Общие комплексы для собак и кошек. Коммерческие лаборатории не работают с РНК. ПЦР может и должна быть дешевой

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод молекулярной диагностики, ставший для многих инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяют гарантированно обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их генетической информации. Аналитическая чувствительность ПЦР для большинства вирусов и бактерий составляет 1000 микроорганизмов в 1 мл пробы. Специфичность ПЦР для вирусных, хламидийных, микоплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%.

Метод ПЦР был разработан сравнительно недавно, но к настоящему времени успел занять передовые позиции как в медицинской, так и в ветеринарной лабораторной диагностике инфекционных и инвазионных заболеваний. Основные принципы ПЦР открыл в 1983 году американский химик Кэри Б. Мюллис, за что и был удостоен Нобелевской премии.

ПЦР-анализ состоит из нескольких этапов. Первый этап - пробоподготовка - заключается в обработке исследуемого материала (приготовление суспензии, центрифугирование). На втором этапе проводится выделение наследственного материала - ДНК или РНК - из клеток. При этом после лизиса клеток и разрушения комплекса «ДНК-белок» производится осаждение ДНК или РНК на сорбенте с последующим переходом их в элюирующий буфер. На третьем этапе проводится амплификация, то есть умножение количества специфических участков ДНК. Для этого используются тест-системы, в состав которых входят праймеры - олигонуклеотиды, которые являются специфическими для каждого возбудителя. К разлитой в микропробирки ПЦР-смеси добавляют образцы и контроли, которые помещают в амплификатор или термоциклер - программируемый термостат с высокой скоростью и точностью задаваемой температуры. Процесс амплификации заключает в себе три стадии: денатурация, отжиг и элонгация. При определении в клинических образцах РНК-содержащих вирусов амплификации предшествует стадия обратной транскрипции, при которой РНК переводят в форму ДНК с использованием фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Четвертый этап ПЦР-диагностики заключается в проведении электрофоретической детекции продуктов ПЦР - ампликонов. При этом продукты ПЦР помещают в лунки агарозного геля и подвергают действию постоянного электрического тока, в результате чего отрицательно заряженная молекула ДНК движется к положительному электроду. В состав геля входит бромид этидия, который, образуя устойчивый комплекс с ДНК, делает эти полосы хорошо заметными при просмотре под ультрафиолетовым облучением (рис. 1).

Рис. 1. Стадии ПЦР

Следует отметить, что для получения достоверного результата ПЦР-анализа необходимым условием является соблюдение правил отбора, хранения и транспортировки клинического материала. Несмотря на то, что ПЦР является очень чувствительным методом, желательно наличие определенного количества возбудителя в пробе.

Взятие материала для ПЦР-исследования следует проводить в одноразовых неталькованных перчатках (так как тальк угнетает ПЦР). При взятии соскобов и смывов следует пользоваться одноразовыми стерильными зондами с повышенной адсорбцией (имеющими на конце щеточку), так как они отбирают оптимальное количество материала.

Соскобы и смывы со слизистых оболочек носа, ротовой полости, влагалища, конъюнктивы отбирают в одноразовые пластиковые микропробирки - эппендорфы - объемом 1,5 мл, в которые разлито по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Желательно не использовать зонды с ватными наконечниками. Следует также избегать отламывания кончика зонда в пробирку с физиологическим раствором, так как это затрудняет дальнейшую обработку и повышает риск перекрестной контаминации проб. Для получения необходимого количества материала достаточно вращать зонд в пробирке в течение 1-2 минут, избегая разбрызгивания жидкости. Проба должна быть мутной на вид, а при отстаивании в ней должен образовываться небольшой осадок.

Забор крови проводят одноразовой иглой в одноразовый шприц или в стеклянную пробирку без антикоагулянта. При заборе в шприц, кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку. Возможно использование вакуумных систем («Vacuette») для забора крови. Для исследования можно предоставить сыворотку крови: пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка, затем центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут и переносят в количестве не менее 1 мл в стерильные эппендорфы объемом 1,5 мл.

Сперму отбирают в стерильные одноразовые пробирки или флаконы.

Моча. Отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не менее 20-40 мл в стерильный сухой флакон или пробирку.

Фекалии. Отбирают пробы массой 1-3 грамма из предварительно продезинфицированного и вымытого лотка, одноразовыми лопаточками переносят в стерильный флакон.

Кусочки пораженных органов от павших животных отбирают в стерильные одноразовые контейнеры или в чистые стеклянные или пластиковые емкости.

Следует строго соблюдать температурные режимы хранения и транспортирования отобранного материала. Транспортирование осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. При хранении материала более суток его необходимо заморозить при Т минус 20°С.

Наиболее часто встречающимися заболеваниями у кошек и собак являются конъюнктивит, ринотрахеит, а также энтерит. Для того чтобы выяснить этиологию заболевания, требуется провести качественную лабораторную диагностику.

Причиной коньюнктивитов или инфекций верхнего респираторного тракта у кошек может быть инфицирование следующими микроорганизмами: герпесвирус типа 1 (FHV1), калицивирус кошек, Chlamediapcittaci. Mycoplasma felis, Bordetella bronchiseptica, Feline reovirus, Staphylococ-cuc aureus, Brohaemolytic streptococcic и Salmonella tephimurium.

Наиболее частой причиной, по данным различных авторов и методов исследования, являются герпес-вирус типа FHY1 (от 10% до 34%) и калицивирус кошек (от 20% до 53%). Chlamydia pcittaci (от 10% до 35%).

Герпесвирусная инфекция , ассоциирована абортами, высокой смертностью новорожденных (инфицирование почти 60% случаев) с признаками интерстициальной пневмонии.
Калицивирус - тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.

Панлейкопения - контагиозное вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 % заболевших котят).

Настоящим бичом для питомников является инфекционный перитонит кошек - тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус. Вирус реплицируется в миндалинах и энтероцитах тонкого кишечника, рассеиваясь по организму через макрофаги и моноциты. Коронавирусы с низкой вирулентностью вызывают энтериты средней тяжести, чаще всего у котят после отъема от матери. Высоковирулентный коронавирус может привести к развитию сухого или выпотного перитонита. Перитонит часто сопровождается почечной недостаточностью, печеночными и неврологическими симптомами.

При инфицировании аденовирусами обоих типов и вирусом чумы плотоядных у собак проявляется общий комплекс симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы.

При чуме плотоядных клинические признаки могут включать серозно-слизистые назальные и конъюнктивальные выделения, кашель, одышку, пневмонию, рвоту и понос, а также лихорадку и гиперкератоз.

Аденовирус плотоядных . Возбудитель - ДНК-содержащий аденовирус плотоядных первого типа (вызывает инфекционный гепатит плотоядных) и второго типа (вызывает аденовироз собак). Наблюдаются лихорадка, апатия, анорексия, жажда, рвота и понос, болезненность брюшной стенки при пальпации. Иногда развиваются конъюнктивит, кератит, светобоязнь. Могут быть точечные кровоизлияния на слизистой оболочке и коже. Редко наблюдаются неврологические нарушения.

Все перечисленные заболевания имеют высокий индекс контагиозности и ассоциированы с высокой смертностью среди щенков, от парвовирусного энтерита погибает 10-50% заболевших щенков, при инфицировании не вакцинированных щенков вирусом чумы плотоядных смертность доходит до 100%.

Токсоплазмоз . Возбудитель - простейшее Toxoplasma gondii. Размножение возбудителя происходит у кошек на стенках кишечника. С калом они выделяют во внешнюю среду ооцисты.

Тканевые цисты могут вызывать анорексию, угнетение, кератиты, желтуху, рвоту, понос и неврологические симптомы в зависимости от пораженных органов. У собак клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, атаксия, паралич) или токсоплазмозный миозит (нарушение походки, атрофия мышц, ригидность), а также миокардит и гепатит.

Хламидиоз и орнитоз . Возбудители у кошек - Chlamydophila felts, у собак - Chlamydophila abortus, Ch. pecorum, у тех и у других заболевание может вызывать Ch. psittaci. У птиц - Ch. psittaci.
У кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается неонатальныи хламидиозный конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в патогенезе атеросклероза у собак.

Микоплазмоз . Возбудители - микроорганизмы рода Mycoplasma. Протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов.

Вирусный иммунодефицит кошек. Иммунодефицит кошек - тяжелое заболевание, вызываемое вирусом из семейства Retrovoridae, рода Lentivirus. Вирус поражает иммунную и нервную системы. Обладает тропизмом к Т-лимфоцитам. В результате иммунодепрессии организм становится беззащитным против бактерий, грибов, вирусов и погибает от вторичной инфекции.
Клинические признаки развиваются медленно, и заболевание чаще регистрируется среди кошек 6-10 лет.

Встречаются у домашних животных и такие заболевания как: лептоспироз собак, листериоз кошек и собак, иерсиниоз щенков, бруцеллез, ротовирусный энтерит, бешенство.

Правильность постановки ПЦР-анализа и качественное выделение инфекции зависит, в первую очередь, от правильности взятия материала, во-вторых, от соблюдения температурного режима хранения и транспортирования проб. Поступившая в лабораторию проба регистрируется, проходит все стадии ПЦР, подвергается электрофоретической детекции с последующей выдачей конечного результата.

Таким образом, высокая чувствительность и специфичность ПЦР-метода позволяет гарантированно обнаруживать единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, что позволяет поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия.

И.М. Донник, член-корреспондент РАСХН, д.б.н., профессор, Н.А. Пелевина, м.н.с, О.Г. Бодрова, м.н.с,
ГНУ Уральский государственный научно-исследовательский ветеринарный нститут РАСХН

Ветеринарный врач-терапевт ИВЦ МВА

В современном мире очень многие люди отдают свое предпочтение кошкам за их большую независимость от человека, в отличие от собак, которым нужно уделять время; приспосабливание к одиночному образу жизни, грацию и умение согреть своего владельца в холодные зимние дни. Любящий и заботливый владелец пытается оградить своего питомца от неприятностей в виде различных заболеваний, которыми болеют кошки.

Данная забота проявляется в качественном питании и своевременной профилактике вирусных заболеваний. К сожалению, есть ряд видовых неизлечимых вирусных инфекций, которым подвержены кошки. При отсутствии симптомов заболевания и специфической диагностики можно прожить с животным длительное время, не подозревая о наличии хронической вирусной инфекции (далее ХВИ) у любимца. В данной статье хочется подробно раскрыть опасность ХВИ, постараться избежать данной проблемы при приобретении желанного котенка.

Итак, что же представляют собой хронические вирусные инфекции и какую опасность они в себе несут для наших питомцев. ХВИ – это вирусные заболевания, обладающие длительным инкубационным периодом, который может длиться от нескольких недель и продолжаться до нескольких лет. Заражение может произойти, как внутриутробно, так и при контакте здоровых кошек с больными животными, а также носителями.

Коронавирусы – этоРНК- содержащиевирусы. Данное название эти вирусы приобрели из-за схожести отростков в форме булав с corona spinarum. Причина инфекции – вирус семейства Коронавириде. Имеются 2 патогенных штамма - ближайшие родственники одного и того же микроорганизма. Один вызывает перитонит, другой – энтерит.

Делятся коронавирусы на 3 формы:

Бессимптомная форма - животное может быть носителем вируса и способно заражать других кошек, при этом жизни ничего не угрожает.

Легкая форма, она не опасна и способна вызывать достаточно легко протекающие недомогания – энтериты (кишечные коронавирусы кошек - FECV).

Высоко патогенная форма – вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV). В организме происходят губительные изменения во всех системах и органах, что приводит к смерти.

Коронавирусный энтерит (FECV) относительно безопасный и возникает у животных в молодом возрасте, в основе симптоматики - жидкий стул, который редко приводит к смерти; Зато крайне опасен вирусный перитонит кошек, поскольку имеет высокую смертность. FIPV и FECV достаточно взаимосвязаны между собой, эти микроорганизмы считаются единой популяцией вирусов, но с разной степенью патогенных изменений. Исследования показали, что коронавирусный энтерит в процессе мутации переходит в вирусный перитонит.

Передача инфекции ороназальная, т.е. заражение происходит через дыхательный тракт воздушно-капельным путем, через фекалии, выкармливание котят, при вязках. У кошек, живущих поодиночке, подобное заболевание встречается реже, больший процент этого заболевания приходится на выставочных кошек, а также кошек, живущих в больших группах.

Симптоматика

Различают 2 формы ВИПК:

1. Экссудативная (с «выпотом»)

«Влажный» перитонит сопровождается ярким признаком наличия жидкости в грудной или брюшной полостях. Жидкость в основном имеет светло-желтый оттенок, имеется некоторая ее тягучесть.

При скоплении биологической жидкости в грудной полости, у животного происходит нарушение дыхания в результате выпота, при этом кошка принимает вынужденную позу. Дыхание чаще грудо-брюшного типа.

При скоплении жидкости в брюшной полости владельцы чаще обращают внимание на увеличившийся живот у питомца.

Также может наблюдаться:

• повышенная температура (не всегда);
• потеря веса;
• общая слабость, угнетение;
• увеличение лимфоузлов;
• снижение или потеря аппетита.

2. Неэкссудативная («сухая»)

При этой форме симптомы часто слабо выражены. Данная форма трудно диагностируется. Характерные ее признаки – потеря веса и отсутствие аппетита.

Диагностика. Происходит комплексно. Для начала у животного забирают клинический и биохимический анализы крови; проводят УЗИ брюшной полости; серологические методы исследования (ИФА - определение количества антител к данному заболеванию; или ИХА – экспресс-тест), также исследуют выпотную жидкость.

Прогноз . Неблагоприятный. Иногда при экссудативной форме ВИП после удаления жидкости и проведенного симптоматического лечения развивается «сухая» форма болезни. Кошки с «сухим» ВИПК могут жить до года.

Лечение . К сожалению, лечения от этого заболевания нет, проводится лишь симптоматическая терапия, направленная на улучшение качества жизни питомца.

Профилактика . Направлена на уменьшение количества кошек, содержащихся в одном помещении (максимум 6-10 кошек). Чистота и своевременная дезинфекция используемых лотков и достаточное их количество, частая смена наполнителя.

Это хроническое вирусное заболевание, характеризующееся ослаблением иммунной системы, развитием анемий, лимфосарком. Очень подвержены этой инфекции молодые животные. ВЛК диагностируют во всех странах мира, заболевание поражает кошек разных возрастных групп и пород.

Пути передачи . Фекально-оральный (слюна, фекалии, выделения из носовой полости), через молоко инфицированных кошек, укусы, при контакте с больным животным от кошки к кошке, возможна передача блохами, а также при несоблюдении правил асептики и антисептики во время инъекций, взятия крови.

Патогенез . ВЛК обусловлено генетической предрасположенностью, а также иммунологической недостаточностью животных. У больных кошек с титром антител 1:32 клинической картины заболевания может не быть, но таких животных причисляют к вирусоносителям. Антитела могут не выявляться и у клинически больных кошек. ВЛК угнетает деятельность красного костного мозга, это приводит к анемии, снижает иммунитет и способствует развитию других болезней.

Клиническая картина Существуют три формы заболевания:

1. Устойчивая или персистентная. Иммунитет у такого животного сильно ослаблен, болезнь достаточно быстро прогрессирует и лечение чаще всего неэффективно.
2. Скрытая или латентная. У животного происходит нарушение кровообращения. Вирус проникает в лимфатическую систему и красный костный мозг. Животное начинает чаще болеть, появляются опухоли.
3. Переходная или транзиторная. Благодаря сильному иммунитету животное через 3 месяца после заражения восстанавливается.

Чащевсегоутаких животныхнаблюдаетсявыраженная анемия, иммуносупрессия (предрасположенность к другим инфекциям или ее наличие), лимфосаркома – множественная или нетипичная. Инкубационный период 60-80 дней, иногда от 2 до 6 лет. ВЛК протекает в латентной форме без проявления клинических симптомов инфекции и может не проявлять себя в течение длительного времени. Под влиянием негативных факторов (смена условий кормления, переохлаждение, стрессы) вирус активируется, и развивается заболевание. В самом начале можно отметить изменения в крови (лейкоцитоз, лимфоцитоз, появление атипичных клеток крови); бледность/иктеричность слизистых, увеличение лимфоузлов, похудание, снижение аппетита, расстройство пищеварения.

Диагностика

Происходит на основании клинико-гематологических, серологических и вирусологических исследованиях. К наиболее значимым методам диагностики можно отнести:

• Иммуноферментный анализ (ИФА), иммунохроматографический анализ (ИХА). Зачастую встречаются ложноотрицательные результаты.
• Клинический анализ крови.
• Биохимия крови.
• УЗИ брюшной полости.
• Биопсия и гистология.

Лечение . Лечения не существует. Оно направлено на проведение симптоматической терапии и на улучшение качества жизни животного. Например, при сильно выраженной анемии назначается переливание крови, а также применение препаратов, которые стимулируют выработку эритроцитов в красном костном мозге. Назначаются препараты, стимулирующие повышение иммунной системы. При обнаружении лимфом назначается химиотерапия.

Профилактика . Вирус очень нестоек во внешней среде, вне живого организма он погибает через двое суток. Чтобы уничтожить этот вирус достаточно хорошо продезинфицировать помещения и предметы ухода за животными, миски и прочее. Содержание питомца в чистоте, полноценное питание и ограничение контакта с бездомными животными – залог здоровья питомца.

Это заболевание опасно только для кошек, для человека и других видов животных оно не представляет никакого риска.

Основным методом предупреждения данного заболевания является вакцинация. Для таких целей используется вакцина Purevax FeLV и Лейкоцел. Вакцинацию проводят с девятинедельного возраста. Производится иммунизация двукратно, с интервалом в 21 день. Далее прививать кошек следует раз в год.

Вирусный иммунодефицит (ВИК, FIV)

Инфекционное заболевание кошек, характеризующееся хроническим течением, сопровождающимся поражением иммунной системы, высокой летальностью.

Это заболевание приобрело эндемический характер у кошек во всем мире.

Вирус сохраняется при комнатной температуре около 4-х суток. При нагревании до 60 градусов происходит гибель вируса в течение получаса, во время кипячения он погибает. При обработке спиртосодержащими препаратами вирус инактивируется через 5-10 минут. К ультрафиолету ВИК достаточно устойчив.

ВИК чаще болеют бездомные кошки, приблизительный возраст животных составляет 5-10 лет.

Пути передачи . Основной путь – укусы больных животных, непородистые кошки чаще инфицируются; также инфекция распространена среди животных, у которых имеется свободный доступ на улицу. Заражение возможно при взаимном вылизывании. Вирус обнаруживают в слюне, крови и других жидкостях.

Клиническая картина. Клинические признаки довольно неспецифичны и достаточно разнообразны. Они отражают сопутствующие инфекции, которые развиваются на фоне снижения иммунной системы. У животных появляется:

• Слабость;
• Потеря аппетита;
• Гингивиты;
• Хроническая диарея;
• Потеря веса и др.

Из-за того, что у животного происходит сбой в работе иммунной системы, к ВИК могут присоединиться различные инфекции: кальцивироз, хламидиоз, вирусный лейкоз и пр., которые усугубляют общее состояние.

У кошек с ВИК повышен риск развития лимфомы, клинические признаки могут быть сходны с проявлениями ВЛК.

Диагностика . Используют клинические лабораторные исследования: ОКА крови (может наблюдаться нейтропения, лимфопения, анемия, моноцитоз). При биохимическом анализе крови обнаруживается большое количество белка, повышение активности печеночных ферментов, азотемия, гипергликемия.

Существует несколько специфических исследований этого заболевания:

Метод иммуноферментного анализа (ИФА); ИХА.

Вирус можно определить методом ПЦР, если серологические тесты дают отрицательный результат.

Лечение. Специфическое лечение в настоящее время отсутствует.

Отмечено, что при лечении Зидовудином у многих кошек улучшается клиническое состояние и работа иммунной системы. Эти препараты дорогостоящие и могут вызывать значительные побочные реакции, например, анемию. Также применяются иммуномодуляторы, которые благотворно действуют на организм.

Клинически нездоровых и кошек с пониженной иммунной системой прививать не следует.

Профилактика . Вакцин не существует. Минимизирование контакта с кошками вне дома. Соблюдение режима питания, содержание животных в чистоте, дезинфекция предметов ухода и своевременная замена наполнителя в лотках. При появлении новых животных – обязательный карантин и диспансеризация нового питомца.

Любите своих питомцев!

Список используемой литературы:

• Гаскел, Беннет: Справочник по инфекционным болезням собак и кошек, Аквариум-принт, 2015 г.
• Различные источники из интернета

Коронавирусные инфекции кошек и собак вызываются представителями рода Coronavirus (семейство Coronaviridae). Основным проявлением коронавирусной инфекции у собак является диарея. V кошек коронавирусы вызывают энтериты и инфекционный перитонит, широко распространенные среди диких и домашних кошек.

Возбудителем коронавирусной инфекции у собак является Canine coronavirus, вызывающий острый коронавирусный энтерит. Заболевание передается при непосредственном контакте с носителем вируса (через слюну и фекалии). Данной инфекции подвержены собаки любого возраста, однако чаще всего поражаются щенки и ослабленные животные, которые уже перенесли другую болезнь, например парвовирусную инфекцию.

Основные симптомы заболевания - рвота и диарея, иногда с примесью крови, обезвоживание организма, потеря в весе, апатия. Через 3-4 недели после выздоровления может развиться повторное заболевание. При проведении диагностики коронавирусный энтерит собак необходимо дифференцировать от парвовирусного энтерита, аденовирусной инфекции кишечного типа и чумы плотоядных.

Коронавирусы, поражающие кошек, представлены двумя биотипами: FECV, или коронавирус энтерита кошек, и FIPV - вирус инфекционного перитонита кошек (2, 3). Носителями FECV является 16-50% домашних кошек, у которых вирус локализуется в тонком кишечнике, не вызывая заболевания или становясь причиной легкой диареи. В то же время у 5-12% носителей может наблюдаться мутация условно-патогенной кишечной формы FECV в патогенную (FIPV), что приводит к развитию болезни (2).

Инфекционный перитонит (ИП, FIP) кошек, заканчивающийся, как правило, летально, протекает в двух формах - влажной и сухой. Влажная (экссудативная) форма ИП характеризуется поражением кровеносных сосудов брюшной или грудной полостей, сопровождающимся выпотеванием плазмы в указанные полости (рис. 1). У больных животных, развивается асцит (рис. 2), а в случае скопления жидкости - нарушение функции дыхания. На серозных покровах органов брюшной полости формируются фибринозные наложения (рис. 3), в дальнейшем могут образовываться спайки. Вследствие нарушения функции печени наблюдается эктеричность склер и кожных покровов.

Сухая (неэкссудативная) форма ИП протекает без скопления жидкости в брюшной и грудной полостях. В этом случае страдают внутренние органы - головной мозг (рис. 4), печень, почки, поджелудочная железа, в 25% случаев наблюдаются поражения глаз (рис. 5) (5).

Поскольку эффективная схема лечения ИП пока не разработана, первостепенное значение имеют профилактические меры, направленные на раннее выявление вирусоносительства (1, 3).

Диагностика инфекционного перитонита кошек также представляет серьезную проблему. Традиционные методы выявления возбудителя, основанные на обнаружении антител к коронавирусам (РНГАи ИФА), дают до 60% ложноположительных результатов. Это обусловлено присутствием в кишечнике кошек условно-патогенных штаммов возбудителя (2, 3). В ряде зарубежных лабораторий применяется комплексная методика диагностики ИП, включающая определение:
- титра антител к коронавирусу;
- соотношения альбуминов/глобулинов в транссудате или плазме крови;
- уровня а-1 кислого гликопро-теина (AGP);
- цитологических и гематологических показателей (4).

Материалы и методы
В исследовании был использован штамм коронавируса «Багира» (5 1оg ТЦД50/мл) в разведениях, 8 изолятов коронавирусов кошек (FCoV), 2 изолята коронавируса собак (CCV) и суспензии вируса панлейкопении кошек и калицивируса кошек.
При испытании ПЦР-тест-системы использовался биологический материал здоровых кошек, животных с клиническими признаками ИП и кошек с неспецифическими симптомами. Среди исследованных животных были как содержащиеся в питомниках, так и находящиеся на индивидуальном содержании.
Биологический материал параллельно исследовался методами ПЦР и РИГА. С помощью ПЦР-системы исследовались фекалии, плазма крови, транссудат при специфическом асците, а методом РИГА - сыворотка крови и транссудат.

Серологические тесты проводились с использованием набора для выявления антител к коронавирусам плотоядных в РИГА (ТУ 9388-025-00494189-01). Биологический материал собак исследовался методом ПЦР.

Однако данное исследование требует значительных затрат времени и средств. В связи с этим эффективным методом диагностики ИП может служить полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая позволяет не только выявлять коронавирусы кошек, но и проводить дифференциацию условно-патогенных и патогенных штаммов исходя из различной локализации их в организме. При этом обнаружение вируса в фекалиях кошек свидетельствует о носительстве условно-патогенных штаммов (FECV), а в плазме крови или асцитной жидкости - о циркуляции в организме животного патогенных штаммов (FIPV) и, следовательно, о заболевании.

Цель настоящего исследования - испытание тест-системы для диагностики коронавирусной инфекции у кошек и собак на основе ПЦР.

Выделение РНК проводилось с использованием набора «РНК-сорб» (ЦНИИЭ), в основе которого лежит метод ее сорбции на силикагеле. ПЦР проводилась на амплификаторе ТЕРЦИК («ДНК-технология») по стандартной методике. Полученные ПЦР-продукты визуализировались методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Результаты и обсуждение
В процессе исследования проведен анализ сведений о нуклеотидных последовательностях представителей семейства Coronaviridae, в частности различных изолятов коронавирусов кошек и собак, опубликованных в базах данных Entrez, GeneBank, EMBL и DDBJ. Кроме того, изучена литература, характеризующая структуру геномов FCoV, CCV и их генетическое родство с другими представителями семейства.

В качестве мишеней для специфических праймеров были выбраны две консервативные последовательности в гене нуклеокапсидного протеина. Специфичность предложенных праймеров изучалась с помощью компьютерных программ FASTA и BLASTA. В результате проведенной работы была выявлена гомология выбранных олигонуклеотидов только с генами нуклеокапсидного протеина FCoV и CCV и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями иных видов семейства Coronaviridae, а также каких-либо других вирусов, бактерий или эукариот. Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.

На следующем этапе исследования были оптимизированы условия выделения РНК вируса и проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР, а также определены специфичность и чувствительность ПЦР-анализа. Размер ПЦР-продукта составил 350 пар нуклеотидов. Метод показал 100% специфичность и высокую чувствительность. Обнаружение коронавируса в фекалиях кошек свидетельствовало о носительстве его условно-патогенных штаммов в кишечнике, обнаружение FECV в транссудате и плазме крови - о развитии заболевания.

При исследовании методом РНГА положительным результатом считалось обнаружение у животного титра антител > 1:128. Однако это могло указывать как на вирусоносительство, так и на манифестированную форму инфекции. Кроме того, положительный титр мог быть обусловлен наличием контакта с коронавирусом ранее. В качестве материала от собак исследовались фекалии, и обнаружение в них РНК коронавируса свидетельствовало о заболевании, вызванном CCV.

В ходе эксперимента был исследован биологический материал, взятый у 193 кошек (таблица). Методом РНГА положительный результат был зафиксирован у 131 животного (титры антител > 1:128). При тестировании «сероположительных» кошек методом ПЦР РНК коронавируса была обнаружена в плазме и асцитной жидкости у 12 животных (9%), только в фекалиях - у 68 (52%) и у 51 (39%) - не обнаружена вовсе. Таким образом, 52% кошек с серопозитивным результатом являлись носителями условно-патогенных штаммов коронавируса, а 39% были здоровы. Очевидно, что исследование методом РНГА дало 63% ложноположительньгх результатов (в пересчете на общее количество исследованных животных).

Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о том, что диагностика коронавирусной инфекции кошек традиционным серологическим методом (РНГА) дает более 60% ложноположительных результатов, поскольку не позволяет дифференцировать состояние носительства от истинного заболевания. Кроме того, "сероположительными» считались животные, имевшие контакт с коронавирусом ранее.

Использование метода ПЦР позволило провести дифференциацию условно-патогенных и патогенных штаммов в связи с их раз личной локализацией в организме и отличить состояние носительства от заболевания. Таким образом, данные проведенного исследования говорят о целесообразности использования метода ПЦР для выявления коронавирусов кошек и собак и постановки окончательного диагноза.

В соответствии с приказом № 45 Департамента ветеринарии МСХ РФ в период с 03.08.2004 г. по 06.08.2004 г. были проведены комиссионные испытания тест-системы для диагностики инфекционного перитонита кошек методом ПЦР. Тест-система успешно прошла комиссионную апробацию, показав 100% специфичность и высокую чувствительность в рамках предложенной панели. В настоящее время тест-система «Коронавир» для выявления и идентификации коронавирусов кошек и собак, основанная на ПЦР, успешно используется в ветеринарной практике (ТУ 9388-142-00494189-05; РУ № Р077-1-3.5-0813 зарегистрирована в РФ за № ПВР-1-3.5/01556 от 30.06.06 г. сроком на 5 лет).

ЛИТЕРАТУРА
1, Addie, D, D„ Jarrett, 0. Use of a reverse- transcriptase polymerase chain reaction for monitoring the shedding of feline coronavirus by healthy cats, Vet. Rec, 2001, May 26; 148 (21): 649-53,
2, Vennema, H, atal. Feline Infectious Peritonitis Viruses Arise by Mutation from Endemic Feline Enteric Coronaviruses, Virology, 1998:150-157.
3, Herrewegh, A.A., Mahler, M„ Hedrich, H.J., Haagmans, B.L Egberink, H.F., Horzinek, M.C., Rottier, P.J., de Groot, R,J, Persistence and evolution of feline coronavirus in a closed cat-breeding colony Virology 1997, Aug 4; 234 (2): 349-363,
4, Comparison of Different Tests to Diagnose Feline Infectious Peritonitis; Katrin Hartmann at al„ 2003.
5, Feline infectious peritonitis; Stacy E, Andrew, Veterinary clinics of North America: small animal; vol. 30, number 5, September 2000

Е.А. ЯРАЛОВА, И.Л. ОБУХОВ, ММ РАХМАНИНА, Э.И. ЭЛИЗБАРАШВИЛИ, В.И.УЛАСОВ,
Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, г. Москва

ПЦР- это полимеразная цепная реакция, основанная на принципе копирования определенного участка нити ДНК. За счет многократного увеличения в объеме ДНК-материала, становится возможным обнаружить в микроскопе искомые бактерии. Преимуществом ПЦР является:

• высокая чувствительность;
• высокая специфичность;
• выявление острых и латентных инфекций;
• возможность выявления любого из ныне известных возбудителей.

ПЦР в ветеринарии

В настоящее время метод ПЦР диагностики нашел широкое применение в ветеринарии. Данный метод исследования позволяет в короткие сроки получить достоверный ответ. К тому же для его проведения необходимо очень малое количество биологического материала, в отличии, например, от общего анализа крови, что существенно упрощает работу ветеринарным врачам. Как у людей, так и у животных материалом для постановки ПЦР могут быть:

• кровь и ее компоненты;
• моча;
• биоптат желудка;
• слюна;
• соскобы эпителиальных клеток.

Проведение ПЦР-диагностики кошкам

Во время обследования кошки ветеринаром, для подтверждения или опровержения предполагаемого диагноза может возникнуть необходимость сделать анализ кошке на ПЦР. Причиной назначения такого исследования могут быть наиболее часто встречающиеся и в тоже время трудно диагностируемые заболевания, такие как перитонит, ринотрахеит, коронавирус, токсоплазмоз и др.

Особо тяжелым заболеванием, при котором необходим ПЦР-метод является вирусный иммунодефицит кошек. Этот вирус поражает не только иммунную, но и нервную системы животного. Организм кошки становится ослабленным и беззащитным перед бактериями и вирусами, в результате чего животное погибает от вторичных инфекций. И дабы исключить наличие этого вируса, ветеринарный врач рекомендует проводить кошке полимеразную цепную реакцию.

Данный метод, помимо многообразия преимуществ, имеет ряд недостатков. Все аппараты для ПЦР-диагностики очень чувствительны, и поэтому малейшее его загрязнение может дать ложный положительный ответ. Так же не маловажной считается дороговизна оборудования и реактивов, поэтому не каждая ветклиника в Москве может его приобрести. Однако, диагностика заболеваний без этого метода становится все более затруднительной, поэтому проведение анализа ПЦР у кошек в Москве можно сделать в нашей клинике обратившись по контактным телефонам, или оставив заявку на сайте.

Современная ветеринария активно применяет на практике все передовые научные достижения. Это помогает добиться высоких результатов в диагностике инфекционных заболеваний у животных. Например, сегодня уже просто невозможно обойтись без такого передового метода, как ПЦР (полимеразная цепная реакция). Данная методика позволяет безошибочно выявить возбудителей целого ряда инфекций, которыми страдают кошки. Причем поставить диагноз в большинстве случаев удается на самых ранних этапах патологического процесса. получить результат этого высокоточного тестирования можно всего через несколько часов после взятия пробы.

Зачем проводится такая диагностика

Чтобы понять, чем отличается ПЦР диагностика кошек, надо иметь представление об инфекциях, которые чаще всего поражают этих животных.

Среди всех патологий, вызываемых вирусами, чаще всего ветеринары сталкиваются со следующими болезнями:

• Вирусным иммунодефицитом
• Лейкозом, развитие которого провоцирует вирус
• Инфекционным перитонитом

Эти три заболевания считаются неизлечимыми, и нередко они приводят к смерти животного.

Но благодаря внедрению ПЦР-диагностики многим питомцам удалось продлить жизнь. И даже в случае обнаружения возбудителя одной из этих инфекций при правильной программе лечения животное может вести активный образ жизни, радуя своего владельца.

Что представляет собой данный метод исследования

ПЦР - диагностика является молекулярным методом выявления инфекций. Его специфические особенности позволяют обнаруживать в биологическом материале даже единичных представителей патогенной флоры. Данная методика появилась в конце прошлого века, а точнее - в 1983 году. Ее автор американский химик К. Мюллис за свою разработку был удостоен Нобелевской премии.

Анализ ПЦР состоит из трех этапов:

• Сначала обрабатывается материал, подлежащий исследованию
• Затем из него выделяется наследственная основа (РНК, ДНК)
• Последняя фаза заключается в проведении амплификации (умножение выделенных участков ДНК)

Стоит заметить, что достоверный результат можно получить только в том случае, когда материал животного берется при соблюдении всех правил.

Какие материалы берутся на анализ

При проведении ПЦР диагностики кошек можно брать на анализ абсолютно любой материал:

• Каловые массы.
• Мочу.
• Слизистые выделения.
• Фрагменты пораженных органов и прочие биологические субстанции. Забор материала производится в специальные контейнеры, а затем направляются в лабораторию на исследование.

Когда необходима ПЦР-диагностика

Данный вид исследования сегодня просто незаменим. Его возможности трудно переоценить, особенно в тех случаях, когда речь идет об инфекционном перитоните кошек. Это заболевание считается самым распространенным и коварным. Вот почему диагностика с применением метода ПЦР получила такое широкое распространение в ветеринарной практике. Тест на наличие инфекционных возбудителей этим методом следует проводить всем кошкам, которые регулярно бывают на улице.

Поскольку наша лаборатория располагает всем необходимым для проведения этого высокочувствительного теста, что позволяет проводить качественную диагностику. Если своевременно выявить источник болезни, можно составить адекватную для конкретной кошки программу терапии и профилактические мероприятия.